细胞库的建立绝非单一部门或简单操作就能够完成，而是一项高度系统化、环环相扣的综合性工程。建库目的是保证细胞制品的可追溯性、安全性与稳定性。这既需要实验人员通过一次次测试来摸索最优条件，最终形成标准操作规程；同时也依赖管理人员严谨把控每个步骤的合理性，并进行有效的风险防控。

对于人诱导多能干细胞（hiPSC）建库与质检流程主要包括：

供者知情同意 → 外周血采集 → PBMC分离 → iPSC重编程、单克隆挑取与筛选 → 三级细胞库建库与库检 → 细胞库的管理、储存与放行等。

由经培训的专业人员，向供者或其法定监护人充分告知：

供者自愿签署书面知情同意书后，建立供者唯一识别码（伪名化编码），记录性别、年龄、既往病史、家族遗传病史，必要时采集ABO/Rh血型及HLA-A/B/DR分型。供者传染病学筛查结果（HIV、HBV、HCV、EBV、HTLV、HCMV、TP等）需为阴性。以上所有资料将保密存储。

采血操作：供者传染病学筛查结果符合要求、知情同意书签署后，在具备资质的医疗机构，由医护人员在无菌条件下用抗凝管采集外周静脉血10 mL左右，标注供者编码及采血时间。血液采集后2 h内进入后续处理流程。

冷链运输与接收：如需此步骤，血液样本应在2℃~8℃避光冷链运输，使用温控记录仪，运输容器应有唯一性标识。接收时核对采集记录、运输温度及密封完整性，并填写《样本接收记录》。若有异常（溶血、凝集、温度超标），按偏差管理程序处理。

PBMC分离：在B级背景下的A级洁净区进行，要求分离后PBMC活率≥90%。PBMC分离后可立即进行红系扩增，也可冻存后复苏再进行。需留存供体原始细胞用于STR、全基因组测序及病原体检测。

iPSC构建与初步筛选流程

重编程：使用非整合型重编程系统（Episomal游离型质粒），避免外源基因整合至宿主基因组。红系扩增过程中对细胞数量进行质控，在扩增7-12天内，细胞数量需达到1x10⁶以上，方可进行后续游离型质粒电转操作。电转后，质粒在细胞中表达Oct3/4, Sox2, Klf4, MYCL1等转录因子，原始细胞进入重编程阶段，细胞由悬浮状态逐渐转为贴壁生长。

克隆形成：电转后7天可见较多贴壁细胞；电转后约12～28d出现典型iPSC克隆。克隆呈圆形或椭圆形，边缘清晰，细胞核质比高，核仁明显。

单克隆挑取：在生物安全柜中，使用显微操作针挑取形态优良的iPSC克隆，转移至预先包被的培养皿中。每个克隆赋予唯一ID，建立克隆档案，关联供者编码。

单克隆扩增：单克隆使用培养基（如TeSR-AOF或TeSR-E8）及基质（Vitronectin或Laminin-521）传代培养，以维持其多能性。由于iPSC单克隆具有异质性，需培养多个单克隆。

单克隆筛选：对单克隆的细胞形态、活率、染色体核型、STR、质粒残留、支原体进行检测，筛选出3个及3个以上合格单克隆进行冻存。通过初步质检的克隆方可进入种子细胞库建库阶段。

种子细胞库（PCB）：将初筛合格的iPSC克隆扩增3-5代，消化后合并为均一的细胞悬液，分装于20~50支冻存管（每支≥1×10⁶活细胞），于液氮罐中储存。冻存管标签信息至少包括：细胞库级、名称、代次、冻存日期、制备人员、编号。仅当所有质检合格后方可升为主细胞库原料。所有检测结果须由质量管理部审核，全部合格后由质量受权人批准放行。

主细胞库（MCB）：复苏质检合格的种子库细胞扩增3-5代，消化后合并为均一的细胞悬液，分装于50~100支冻存管（每支≥1×10⁶活细胞），置于两个不同地理位置的液氮罐（或同一建筑内两个独立罐）中储存。主细胞库须完成全面质检，合格后方可升为工作细胞库原料。

工作细胞库（WCB）：复苏质检合格的主库细胞扩增3-5代，消化后合并为均一的细胞悬液，分装于至少100支冻存管（每支≥1×10⁶活细胞），于液氮罐中储存。WCB与MCB应分别存放在不同区域。WCB不得重复回冻，每次建立新WCB均需质量部门审核放行。

iPSC三级库对比

质量管理体系与人员：设置独立的质量管理部，质量负责人与细胞制备负责人不得兼任。所有操作人员经岗前培训及健康检查，具备细胞生物学及无菌操作技能。关键仪器（液氮罐、培养箱、生物安全柜）均需验证及定期校准。

入库放行与隔离存放：未完成检定的细胞应存放于物理隔离的液氮罐或专用区域，只有检验合格并附批检验报告的MCB/WCB方可移入正式库存区。放行需经质量受权人签署细胞库放行审核单。

深低温保藏与稳定性考察：细胞库储存温度应稳定≤-150℃（液氮气相或液相罐）。液氮罐配备实时温度/液位监控及远程报警系统，定期巡检并记录。每两年开展一次细胞库稳定性考察，复苏一支细胞检测活率、支原体、无菌及多能性，确保细胞特性无改变。

出库与分发：细胞出库须获得质量受权人批准，使用方与供应方签订材料转移协议。运输采用液氮或干冰（维持＜-130℃），实时温度监控。并附带的细胞质量证书，内容包含鉴别、无菌、支原体、多能性、病毒检测摘要及建议用途。

【参考资料】

[1] 中国细胞生物学学会. T/CSCB 0001-2020 干细胞通用要求[S].

[2] 中国细胞生物学学会. T/CSCB 0005-2021 人诱导多能干细胞团体标准[S].

[3] 国家市场监督管理总局, 国家标准化管理委员会. GB/T 42466-2023 生物样本库多能干细胞管理技术规范[S].

[4] 国家市场监督管理总局, 国家标准化管理委员会. GB/T 37864-2019 生物样本库质量和能力通用要求(ISO 20387:2018, IDT)[S]. 2019.

[5] 中国医药生物技术协会. CMBA/T 006-2017 细胞库质量管理规范[S]. 2017.

[6] 国家药典委员会. 《中华人民共和国药典》2020年版 第三部[S].