《Bioactive Materials》：双CAR-NK细胞增强免疫治疗效果

嵌合抗原受体（CAR）工程自然杀伤细胞（NK）细胞在治疗各种癌症方面已经显示出了前景。然而，有限的免疫记忆和获得足够数量的同种异体供体细胞阻碍了其更广泛的临床前和临床应用。为此，普渡大学Philip S. Low、Xiaoping Bao 教授联合宾夕法尼亚州立大学Xiaojun Lance Lian 教授团队评估了8种不同的CAR构建物，使用抗PD-L1纳米体和/或通用抗荧光素（FITC）单链可变片段（scFv）来增强NK-92细胞对异质性实体肿瘤的抗原特异性增殖和抗肿瘤细胞毒性。接下来，用优化的CARs对人类多能干细胞（hPSCs）进行基因工程，并将其分化为功能双CAR-NK细胞。肿瘤微环境响应性抗PD-L1CAR通过抗原依赖性激活磷酸化STAT3（pSTAT3）和pSTAT-2受体β-chan(β-chain（ΔIL-2Rβ）和STAT3结合的酪氨酸-x-x-谷氨酰胺（YXXQ）基序激活pSTAT5信号通路，有效促进hPSC-NK细胞增殖和细胞毒性。PD-L1诱导的记忆样hPSC-NK细胞的抗肿瘤活性通过使用FITC-叶酸双特异性适配器进一步增强，该适配器是可编程的抗FITC CAR和表达叶酸受体的乳腺肿瘤细胞之间的桥梁。总的来说，本研究中hPSC CAR-NK工程平台是模块化的，可以构成一个现实的策略，制造具有免疫记忆样表型的现成CAR-NK细胞，用于靶向免疫治疗。

相关研究内容以“Engineered human pluripotent stem cell-derived natural killer cells with PD-L1 responsive immunological memory for enhanced immunotherapeutic efficacy”为题于2023年4月5日发表在《Bioactive Materials》上。

图1 双CAR hPSC-NK细胞协同增强抗肿瘤作用示意图

如图1所示，在这项研究中，作者首先评估了8种不同的CAR构建物，它们使用抗PD-L1纳米体和/或通用的抗FITC scFv来增强NK细胞的抗原特异性增殖和抗肿瘤细胞毒性。

图2 筛选在NK-92细胞中具有增强抗肿瘤活性和增殖能力的CAR结构

作者设计并评估了8种不同的CAR设计，用于优化NK-92细胞的抗肿瘤细胞毒性和增殖（图2A）。与LNCaP细胞相比，表达CAR的NK-92细胞对MDA-MB-231表现出更强的细胞毒性（图2B）。在双特异性FITC-叶酸适配器存在的情况下，CAR NK-92细胞的抗MDA-MB-231细胞毒性显著增加（图2C），表明我们的anti-FITC CAR的特异性，同时显著增强了IFNγ和TNFα的释放(细胞毒性颗粒）（图2D、E）。在PD-L1+ MDA-MB-231细胞刺激下，CAR NK-92细胞中磷酸化的STAT3（pSTAT3）和pSTAT5水平上调（图2F）。CAR #3、#5和#7也促进了NK-92细胞最大的增殖（图2G）。接着作者构建了一个连续的体外肿瘤细胞暴露模型，来研究CAR工程后NK-92细胞的持久性和记忆样表型（图2H）。在第1天初始抗原暴露下，CAR #1、#5和#6工程的NK-92细胞对FRα+ PD-L1+乳腺癌细胞显示出优越的肿瘤杀伤能力（图2I）。以上研究结果表明，双CAR设计可以协同NK细胞在特异性肿瘤抗原刺激下的多种功能，并在免疫抑制肿瘤微环境下实现具有优越的抗肿瘤活性和持久性的记忆样表型。

图3 CAR工程H9 hPSCs衍生的NK细胞显示出增强的记忆样抗肿瘤细胞毒性

得到的hPSC来源的NK细胞表达了高水平的典型NK细胞表面标记物，包括CD16、KID3DL1、NKp46、NKG2D和NKp44（图3A）。与野生型hPSC-NK细胞相比，CAR工程的NK细胞在2小时内形成了更多的免疫突触（图3B），双CAR-NK细胞与肿瘤细胞形成了最多的免疫突触（图3C）。在对MDA-MB-231肿瘤细胞的反应中，CAR-NK细胞表达了更多的IFNγ和CD107a（图3D），并释放出更多的细胞毒性颗粒TNFα和IFNγ（图3E、F）。接下来评估了不同hPSC-NK细胞的肿瘤杀伤能力，并证明了与野生型、抗-FITC CAR和抗PD-L1 CAR-NK细胞相比，双CAR-NK细胞表现出优越的抗MDA-MB-231细胞毒性（图3G）。单抗原靶向抗PD-L1和双CAR-NK细胞的pSTAT3和pSTAT5的表达水平最高（图3H），并获得了最高的细胞扩增（图3I）。第1天，在抗FITC和双CAR-NK细胞中观察到强烈的初始抗MDA-MB-231细胞毒性（图3J）。

图4 双CAR-hPSC-NK细胞改善了其在体内的持久性

为了确定抗PD-L1CAR对hPSC-NK细胞增殖和持久性的影响，免疫缺陷NRG小鼠移植了表达5×10⁵PD-L1的MDA-MB-231乳腺癌细胞或PD-L1-罕见的LNCaP细胞，在肿瘤细胞注射后7天，静脉输注5×10⁶个不同的hPSC来源的NK细胞或PBS(图4A)。在第6、14、21和28天采集血液进行NK细胞分析，MDA-MB-231小鼠移植瘤模型中抗PD-L1和双CAR-NK组的NK细胞数量明显高于其他组（图4B、C）。通过监测宿主小鼠的体重评估了hPSC来源的CAR-NK细胞的生物相容性，所有实验组均无明显的体重减轻（图4D），表明hPSC来源的NK细胞具有最小的全身毒性和较高的生物相容性。对第30天小鼠的主要器官切片的组织学分析显示，适应性NK细胞在心、肝、肝、脾、肺和肾中没有引起任何明显的异常或损伤（图4E），证实了hPSC来源的NK细胞的生物相容性。

图5 通过静脉注射检测各种hPSC-NK细胞的体内抗肿瘤活性

小鼠皮下注射5×10⁵ MDA-MB-231细胞，并在肿瘤接种7天后系统给予单次注射1×10⁷ NK细胞（图5A）。与用PBS处理的荷瘤小鼠相比，给予hPSC-NK细胞显著降低了肿瘤负荷（图5B-D）。所有非PBS实验组从第14天到第28天在血浆中释放可检测到的TNFα和IL-6，双CAR hPSC-NK细胞保持了两种细胞因子的最高水平（图5E、F），这最终在小鼠中减少，表明细胞因子释放综合征的风险降低。IFNγ在双CAR-NK细胞中的大量产生也与它们的记忆样表型相一致（图5G）。

图6 双CAR-hPSC-NK细胞在体内肿瘤再挑战模型中提高了抗肿瘤活性

作者再次接种MDA-MB-231肿瘤细胞，构建一个肿瘤再挑战模型，用于研究其记忆样行为（图6A）。与其他实验组相比，双CAR-hPSC-NK细胞显著减缓了第二种肿瘤的生长(图6B、C)，并延长了荷瘤小鼠的存活时间（图6D）。以上数据表明，肿瘤微环境响应性抗PD-L1和可编程抗FITC CARs的结合显著增强了hPSC来源的NK细胞的体内持久性和抗肿瘤活性，赋予它们具有改善免疫治疗的记忆样能力。

综上所述，本研究开发了一种新的免疫工程方法，其中hPSCs被双CAR构建，并分化为现成的CAR-NK细胞产品。双抗FITC和抗PD-L1hPSC-CAR-NK细胞的设计和证明具有更高的普遍性、效性、安全性和持久性，实现了NK细胞的记忆样表型。

文章来源：https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2023.03.018，侵删