人类多能干细胞生成真正的下胚层细胞

人类胚胎着床前的早期阶段，囊胚由滋养外胚层（Trophectoderm，TE）和内细胞团（Inner Cell Mass，ICM）组成。ICM会分化成上胚层（即未来的胎儿）和下胚层（即原始内胚层，未来的卵黄囊），这个过程在囊胚的晚期阶段完成。在着床过程中，这两种组织形成一个双层圆盘，作为胚胎的发育模板。然而，由于伦理和法律限制，我们对人类着床前发育的了解仍然很有限。因此，需要开发其他方法来研究这个关键的发育阶段。

近日，来自日本京都大学iPS细胞研究与应用中心的Yasuhiro Takashima和Takuya Yamamoto共同在Nature 期刊发表题为Hypoblast from human pluripotent stem cells regulates epiblast development（人类多能干细胞中的下胚层细胞调控上胚层发育）的文章。研究人员使用遗传和非遗传方法，通过初始人类多能干细胞（human pluripotent stem cells，hPSCs）生成真正的下胚层细胞（hypoblast cells，nHyC），这些细胞可生成胚胎发育所需的两个胚外组织之一。随后，研究人员成功模拟并揭示了两种胚外组织有效指导外胚层阶段特异性生长和发育过程中的机制。该研究在人类胚胎发育着床后阶段的机制研究中具有里程碑意义。

为了模拟人类着床前的发育过程，在体外建立与着床前胚胎相对应的细胞是非常重要的。与小鼠不同，初始hPSCs对应于着床前的上胚层【1】，可以通过生成胚状体（blastoids）并分化为囊胚的TE来进行模拟【2】。尽管有报道称初始PSCs可以分化为下胚层，但其分子细节还不清楚，并且迄今为止还未能成功地获得体外着床前下胚层细胞【3】。因此，我们仍不清楚胚外组织是否能够支持着床前上胚层的发育。

初始hPSCs诱导形成nHyC

先前的研究表明，在小鼠中，Gata6、Gata4和Sox17的过表达可以促使胚胎干细胞（ESCs）分化成下胚层细胞。基于这一发现，研究人员利用GATA6的过表达来诱导初始态hPSCs形成着床前期的下胚层。他们观察到GATA6的过表达能够促使初始态hPSCs分化为下胚层细胞，并观察到了下胚层标志基因（如GATA6、GATA4、SOX17和PDGFRA）的表达上调，以及多能性基因的表达下调。通过对分化过程的RNA-seq分析和PCA分析，确定了初始态和始发态hPSCs之间的基因表达差异，并且观察到初始态G6-PDGFRA+细胞表达了与下胚层和早期胚胎发育相关的基因，而始发态G6-PDGFRA+细胞表达了与中胚层相关的基因。因此，GATA6促进了初始态hPSCs向下胚层分化，而始发态hPSCs则进入了着床后的胚胎发育命运。随后，研究人员对受GATA6过表达影响的信号通路进行研究，以探索信号分子对下胚层细胞形成的作用，并通过转录因子和细胞表面标记物来标记这些细胞。通过GATA6的过表达或7种化学因子（seven factors，7F）对相关信号通路的干扰，研究人员成功地使源自hPSCs的细胞进入类似于下胚层的状态，这些细胞被称为初始hPSC衍生的nHyC。研究还确定了nHyC的细胞表面标记物，包括FOXA2、HNF4A、SP8等转录因子以及ANPEP (CD13) 和CEACAM1。进一步研究发现，与小鼠下胚层不同，人类下胚层的特化并不依赖维生素A和视黄酸（RA）。使用FGF4/BMP4和特定化合物的组合能够成功诱导下胚层基因的表达和nHyC的形成。同时，研究人员还发现，在灵长类动物狨猴的ICM中，BMP/FGF信号也在下胚层特化中起着关键作用。与此同时，研究还指出人类下胚层谱系细胞在不同培养条件下的特点和相似性。数据表明，nHyC和下胚层具有相似的基因表达谱，而RACL（用IPCs诱导因子ACL处理的hPSCs）和始发来源的细胞与着床后的细胞表达模式更接近，这表明nHyC细胞与支持上皮发育的囊胚阶段下胚层非常相似。

Bilaminoids的形成和特征

在围着床期，未极化的初始外胚层（Epi）获得顶基极性，失去多能性，并与下胚层细胞一起形成了双层盘。研究人员使用野生型初始态细胞和过表达GATA6的初始态细胞形成的细胞球来模拟这一发育过程。他们观察到这些细胞球在培养中自我组织，并表现出类似晚期人类囊胚的特征，包括由初始PSC衍生的具有极性的外胚层样细胞（nEpiC）构成的腔体结构bilaminoids，这些结构在形状上类似花环。研究还观察到bilaminoids中不同类型细胞之间的相互作用。此外，研究人员还发现，滋养层细胞（trophoblast-like cells, nTB）对外胚层发育起着重要作用。通过滋养层与初始PSCs的共培养，研究人员发现滋养层的存在能够促进外胚层细胞的增殖，并使双层结构变得更大，更有效地形成前羊膜样腔。研究还发现，滋养层分泌的IL6通过激活STAT3信号传导，对外胚层细胞的增殖和前羊膜样腔的形成起到支持作用。在bilaminoids结构中，外胚层细胞参与了原肠胚的形成。然而，在没有前羊膜样细胞的情况下，即使有nTB和IL6存在，也不会形成腔体和诱导出中胚层基因表达。但是，由7F-nHyC包围的聚集体含有腔体和滋养细胞，其中的nTB提高了bilaminoids的形成效率和前羊膜样腔的体积。研究还发现，nHyC在调控nEpiC原肠胚相关基因的表达中起着关键作用。通过对bilaminoids中的细胞进行单细胞转录组学分析，研究人员确认了各个细胞群的特征。其中一小部分nHyC表达了前脏壁内胚层（anterior visceral endoderm，AVE）的标记基因，这是一个意外的发现。另外，研究还发现，在小鼠胚胎发育过程中，下皮层细胞通过分泌前化因子调控bilaminoids中前后轴的形成。这些下皮层细胞通过抑制并调节上皮细胞中与原肠胚相关基因（如DKK1或OTX2）的表达，参与了胚胎的定向发育。

nHyC和bilaminoids促进外胚层发育

在小鼠胚胎发育过程中，下胚层细胞通过产生基底膜和细胞因子促进外胚层细胞的发育进展。研究人员发现，在人类下胚层细胞中表达了与基底膜相关的蛋白LAMA1、LAMB1和LAMC1，并形成了基底膜与外胚层细胞之间的边界。这些基底膜通过细胞表面受体上的整合素与外胚层细胞进行相互作用，促进bilaminoids花环样结构的形成。同时，下胚层细胞还表达了BMPs、NODAL和WNT11，而外胚层细胞则表达了与这些因子相关的受体。实验结果显示，抑制BMP、Nodal和WNT信号会减少外胚层细胞中胚胎早期发育相关基因的表达。这些发现揭示了下胚层细胞通过产生基底膜和细胞因子与外胚层细胞相互作用，对胚胎的发育和形态发生起到重要的调控作用。最后，研究人员将bilaminoids培养到第9天，观察到其中的细胞开始表达羊膜标记物、原始生殖细胞标记物和血液内皮祖细胞标记物。分析结果显示这些细胞与真实胚胎中相应细胞类型聚类在一起。这些发现表明bilaminoids对于支持外胚层细胞从类似囊胚状态向类似着床后阶段的细胞分化至关重要。

综上所述，研究人员在初始hPSCs中生成真正的nHyC，nHyCs自发地与原始的hPSCs组装，形成具有前羊膜样腔的三维双层结构bilaminoids。第二个胚外组织——滋养层细胞TB存在，可以进一步促进双层结构bilaminoids的形成，支持后期着床胚胎状态的建立。

参考文献

1. Io, S. et al. Capturing human trophoblast development with naive pluripotent stem cells in vitro. Cell Stem Cell 228, 1023-1039 e1013, doi:10.1016/j.stem.2021.03.013 (2021).

2. Kagawa, H. et al. Human blastoids model blastocyst development and implantation. Nature, doi:10.1038/s41586-021-04267-8 (2021).

3. Linneberg-Agerholm, M. et al. Naive human pluripotent stem cells respond to Wnt, Nodal and LIF signalling to produce expandable naive extra-embryonic endoderm. Development 1146, doi:10.1242/dev .180620 (2019).

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原文链接：https://www.nature.com/articles/s41586-023-06871-2

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